Sięgnij po podręcznik pipetowania

W naukach biomedycznych pipetowanie stanowi nieodzowny element prac badawczych. Warunkiem powtarzalności wyników są dokładne pipety z wysokiej klasy końcówkami bez zanieczyszczeń.
W naszym podręczniku pipetowania w naukach biomedycznych wyjaśniono, w jaki sposób wybierać i oceniać pipety oraz końcówki, aby podnieść wydajność pipetowania i zagwarantować sobie lepsze wyniki.

Podręcznik pipetowania w naukach biomedycznych kompleksowo objaśnia następujące zagadnienia:

• Ocena i wybór pipet
• Wybór właściwych końcówek
• Techniki pipetowania

1. Wstęp

Program Good Pipetting Practice (Dobra Praktyka Pipetowania) ma na celu pomagać badaczom w kompetentnym wyborze urządzeń, właściwym pipetowaniu, stosowaniu ergonomicznych technik, kalibracji i rutynowej obsłudze, aby uzyskiwane wyniki były najlepsze z możliwych. Pipetowanie, czyli odmierzanie i przenoszenie małych objętości cieczy, rzędu mikro- i mililitrów, jest zapewne najczęściej wykonywaną operacją w laboratoriach badawczych. Zdolność do wykonania tego zadania w sposób szybki i precyzyjny stanowi bezwzględny wymóg, od którego zależy pomyślność prac laboratoryjnych. Do większości prac laboratoryjnych używa się nowoczesnych pipet z poduszką powietrzną ze względu na ich liczne zalety – idealnie nadają się do skutecznego dozowania małych ilości cieczy. Nowoczesne wysokiej jakości pipety i końcówki umożliwiają uzyskanie wysokiej wydajności, a tym samym zaoszczędzenie roboczogodzin.

2. Planowanie projektu, przebieg prac i wybór

Planowanie projektu i przebieg prac

W przypadku większości nowych projektów warto zastosować pełny proces planowania, w którym wszystkie etapy przebiegu prac analizuje się pod kątem maksymalnej efektywności i pozyskiwania danych. Z perspektywy postępowania z cieczami wymaga to znajomości początkowego typu próbki, wymaganej analizy punktu końcowego oraz wydajności analizy próbek. To z kolei będzie wskazówką do wyboru odpowiednich technik oraz wymaganych formatów pojemników do postępowania z cieczami (probówki, płytki itd.). Na tej podstawie można następnie określić optymalne narzędzia w danym przebiegu prac. W każdym przypadku pipetowania, pipeta i końcówka oraz technika operatorska muszą być traktowane jak jeden system, który ma dostarczać dokładnie odmierzoną wymaganą objętość cieczy. Wybór odpowiedniej pipety i końcówki, a następnie używanie najbardziej efektywnej techniki, stanowią integralną część procesów opracowywania i wdrażania dowolnego projektu lub eksperymentu.

Analiza przebiegu pracy

Pierwszy etap procesu polega na rozpoznaniu wszystkich etapów w przebiegu eksperymentu — od wyodrębnienia próbki na początku po wytworzenie danych na końcu. W grę będą wchodzić wszystkie etapy przygotowawcze na potrzeby przebiegu prac, np. przygotowanie buforów lub mieszanin wzorcowych. Następnie należy ustalić, jak duża zmienność jest do przyjęcia, aby eksperyment mógł dostarczyć dobrych danych. Niektóre aplikacje i etapy są o wiele bardziej zależne od zmienności warunków eksperymentu niż inne, na przykład dowolny eksperyment obejmujący wzmocnienie, m.in. qPCR, może być bardzo wrażliwy na zmienność, natomiast prosty etap przygotowania bufora już nie. Nieoptymalny wybór pipety i końcówki oraz zła technika pipetowania mogą być głównym źródłem zmienności warunków eksperymentu – mogą na przykład poważnie wpłynąć na eksperymenty zależne od krzywej wzorcowej uzyskanej w toku rozcieńczania seryjnego.

Optymalizacja przebiegu pracy

• Wymagania co do zakresu objętości i wydajności analizy próbek
• Wymagania co do formatu pojemnika na próbki/odczynniki
• Szczególne wymagania co do próbek/oznaczania

3. Wybór odpowiedniej pipety

Dostępnych jest wiele narzędzi do pipetowania umożliwiających uzyskiwanie optymalnych rezultatów i większej wydajności, a jednocześnie zapewniających dodatkowe korzyści, takie jak większa ergonomia i lepsza funkcjonalność w danej aplikacji. Istnieją dwa główne typy mikropipet: z poduszką powietrzną i wyporowe (z wyporem bezpośrednim). W obu typach o objętości dozowanej cieczy decyduje średnica tłoka i skok tłoka.

Pipety z poduszką powietrzną

• Niezwykle dokładne w przypadku roztworów wodnych
• Ekonomiczne

Pipety z poduszką powietrzną są najczęściej używanymi przyrządami do pipetowania spotykanymi w laboratoriach. Obsługa pipet polega na umieszczeniu czubka końcówki w próbce cieczy, a następnie zwolnieniu przycisku trzpienia. Gdy tłok pipety przemieszcza się w górę jej korpusu, powstaje podciśnienie, w wyniku czego próbka cieczy przemieszcza się w końcówce do góry, aż do wypełnienia pustki o wybranej objętości powstałej pod wpływem spadku ciśnienia.

Pipety wyporowe

• Niezwykle dokładne w przypadku większości roztworów
• Zalecane do cieczy lepkich, gęstych, lotnych i korozyjnych

Chociaż pipety wyporowe nie są aż tak popularne jak pipety z poduszką powietrzną, często można je spotkać wśród sprzętu laboratoryjnego. W pipetach tych do wytwarzania fizycznej pustki o wybranej objętości służy jednorazowy zestaw złożony z tłoka i kapilary. Tłok bezpośrednio styka się z próbką, a kiedy zostaje przemieszczony do góry, próbka zostaje wciągnięta do kapilary. Pipety wyporowe zapewniają wysoką dokładność i precyzję w przypadku pipetowania roztworów wodnych, niemniej zalecane są do roztworów lepkich, gęstych, lotnych i korozyjnych. Jednorazowe kapilary i tłoki do pipet wyporowych są droższe w porównaniu z jednorazowymi końcówkami do pipet z poduszką powietrzną, dlatego warto zdecydować się na pipety z poduszką powietrzną, jeśli dostarczają takich samych wyników.

Optymalizacja przebiegu pracy

• Wymagania co do zakresu objętości i wydajności analizy próbek
• Elektroniczne pipety jednokanałowe
• Pipety wielokanałowe
• Systemy pipetowania o dużej wydajności
• Pipety specjalne
• Pipety wyporowe
• Pipety powtarzalne
• Sterowniki pipet
• Dozowniki butelkowe

4. Wybór odpowiedniej końcówki: konstrukcja, jakość i dopasowanie

Pipetę i końcówkę zalecaną przez jej producenta najlepiej traktować jako system, a nie dwa osobne komponenty. Końcówki reklamowane jako przeznaczone do wszystkich pipet często wykazują niedostatki pod względem dopasowania lub konstrukcji, ponieważ z założenia mają pasować do rozmaitych modeli. Wybierając końcówki do pipet, należy kierować się ich konstrukcją, jakością i dopasowaniem.

Konstrukcja końcówki

Końcówki do pipet o najbardziej zaawansowanej konstrukcji są elastyczne, cienkościenne i mają mały otwór wylotowy. W przypadku pipetowania małych objętości, poniżej 20 µL, końcówki Rainin FinePoint™ zapewniają lepszą dokładność i precyzję niż końcówki standardowe, które mają grubsze ścianki lub fazowane czubki. Końcówki FinePoint są bardziej elastyczne niż większość końcówek standardowych. Próbka cieczy może z nich wypływać przy dowolnym kącie końcówki, co zapewnia kompletne wydanie. To znaczy, że dużo mniej próbki pozostaje na końcówce w porównaniu z końcówkami o grubych ściankach lub fazowanych czubkach. Różnice w konstrukcji końcówek mają wpływ na działanie, dokładność i precyzję. Niemniej jednak, gdy pipet używa się prawidłowo, to pod warunkiem stosowania końcówek zalecanych przez producenta będą one zapewniać gwarantowaną dokładność i precyzję.

Jakość końcówki

Najpoważniejsze wady jakościowe występują przy otworze wylotowym, czyli na czubku końcówki, gdzie mają największy wpływ na zasysanie i dozowanie. Na rysunku 13 przedstawiono cztery czubki końcówek w powiększeniu.

Wypływka to resztka tworzywa sztucznego pozostała po procesie formowania wewnątrz końcówki lub na obrzeżu otworu.

Wady formowania i wady koncentryczności wynikają z niewłaściwego opalania kołków formujących otwór po wtrysku tworzywa sztucznego do formy. Wszystkie te wady powodują utratę części próbki podczas pipetowania. Wysokiej jakości proces produkcyjny pozwoli do minimum ograniczyć występowanie wad końcówek oraz błędów będących ich następstwem.

Uszczelnienie końcówki pipety

• System odrzucania końcówek LTS™ LiteTouch™
• Wybór końcówek
• Końcówki specjalne do szczególnych zastosowań

5. Techniki pipetowania

Prawidłowa ocena aplikacji oraz oparty na niej wybór przyrządów będą mieć znaczący wpływ na wyniki badań. Nie są to jedyne zagadnienia, jakie badacze powinni wziąć pod uwagę, chcąc uzyskiwać jak najlepsze wyniki badań. Znaczenie mają tu także inne czynniki, takie jak warunki zewnętrzne czy zachowanie prawidłowej techniki pipetowania. Dokładność i precyzja mają w badaniach naukowych zasadnicze znaczenie. Zwięzłe omówienie różnych zagadnień dotyczących technik pipetowania można znaleźć na kolejnych stronach. Czy wiesz, że wystarczy stosować te techniki, aby zwiększyć dokładność i precyzję nawet o 5%?

Optymalny zakres objętości

Normalny zakres roboczy większości pipet wynosi 10–100% objętości znamionowej. Mimo że taki zakres traktowany jest jako roboczy, parametry pipet zmieniają się wraz z obniżaniem ustawienia objętości. Według specyfikacji dokładność 100-mikrolitrowej pipety wynosi +/-0,8% w zakresie 50–100% pojemności znamionowej. Jeśli jednak ustawienie objętości zostanie obniżone do 10 µL (czyli 10% pojemności znamionowej), niedokładność będzie ponad 3-krotnie większa, czyli wyniesie 2,5–3%. Dlatego optymalna objętość, która zapewnia największą dokładność i precyzję, wynosi z reguły 35–100% pojemności znamionowej. Należy starać się unikać ustawiania objętości pipety poniżej 10% ustawienia maksymalnego, a do mniejszych objętości stosować pipetę o mniejszej pojemności.

Głębokość zanurzenia końcówki

Właściwa głębokość zanurzenia końcówki ma szczególne znaczenie w przypadku pipet do mikroobjętości i może poprawić dokładność nawet o 5%. W przypadku pipet do mikroobjętości końcówka powinna być zanurzona na 1–2 mm, zaś w przypadku pipet do dużych objętości na 6–10 mm. Jeśli końcówka zostanie zbyt głęboko zanurzona, objętość znajdującego się w niej gazu zmniejszy się pod wpływem ciśnienia, co spowoduje, że zassana zostanie zbyt duża ilość cieczy. Wyniki może zaburzyć także pozostanie cieczy na powierzchni końcówki. Jeśli końcówka nie zostanie zanurzona dostatecznie głęboko, może zostać wciągnięte powietrze, czego skutkiem będą pęcherzyki powietrza. W obu przypadkach efektem będzie niedokładnie odmierzona objętość.

• Zasysanie pod właściwym kątem
• Zachowywanie spójności
• Spójne dozowanie próbek
• Wstępne płukanie końcówek
• Unikanie wahań temperatury
• Spójne ustawienia mikrometra

Odwiedź stronę METTLER TOLEDO i pobierz opracowanie techniczne.