Dlaczego jakość pobierania próbek i wyposażenia laboratoryjnego decyduje o wiarygodności wyniku?

Badania molekularne wymagają nie tylko czułych metod, ale także najwyższej jakości procesu laboratoryjnego

Pandemia COVID-19 pokazała, jak kluczową rolę odgrywa szybka i wiarygodna diagnostyka molekularna. Laboratoria na całym świecie wykorzystują technikę RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2. Jednak nawet najbardziej zaawansowana metoda analityczna nie zagwarantuje prawidłowego wyniku, jeśli próbka zostanie nieprawidłowo pobrana lub podczas przygotowania analiz dojdzie do degradacji RNA.

W diagnostyce molekularnej dokładność wyniku zależy od całego łańcucha procesu – od pobrania materiału biologicznego, przez transport próbki, aż po jakość wykorzystywanych końcówek do pipet, probówek i innych materiałów eksploatacyjnych.

 

 

 

Dlaczego prawidłowe pobranie próbki jest tak ważne?

Jednym z największych wyzwań diagnostycznych podczas wykrywania SARS-CoV-2 było uzyskanie reprezentatywnej próbki zawierającej odpowiednią ilość wirusowego RNA. Wirus występuje głównie w nosogardzieli oraz dolnych drogach oddechowych, dlatego materiał do analizy musi zostać pobrany zgodnie z rygorystycznymi procedurami.

Nieprawidłowo pobrana próbka może prowadzić do uzyskania wyniku fałszywie ujemnego mimo obecności zakażenia. Ryzyko błędnej diagnozy wzrasta szczególnie wtedy, gdy:

wymaz pobrano z niewłaściwego miejsca,
próbka zawiera zbyt małą ilość materiału biologicznego,
badanie wykonano na niewłaściwym etapie infekcji,
RNA wirusa uległo degradacji przed analizą.

Dla laboratoriów oznacza to konieczność zachowania pełnej kontroli nad każdym etapem procesu przedanalitycznego.

Czym jest wynik fałszywie ujemny?

Fałszywie ujemny wynik oznacza, że test nie wykrywa obecności wirusa pomimo rzeczywistego zakażenia pacjenta.

Przyczyną mogą być zarówno czynniki biologiczne, jak i techniczne. W przypadku SARS-CoV-2 poziom wirusa zmienia się wraz z przebiegiem choroby, dlatego nawet prawidłowo pobrana próbka może zawierać zbyt małą ilość materiału genetycznego do detekcji.

Dodatkowym zagrożeniem jest degradacja RNA. Wirusowe RNA jest cząsteczką wyjątkowo wrażliwą na działanie czynników środowiskowych i enzymatycznych, co sprawia, że utrzymanie jego integralności stanowi jedno z najważniejszych wymagań diagnostyki molekularnej.

Jak działa diagnostyka RT-PCR?

RT-PCR jest metodą wykrywania materiału genetycznego wirusów RNA, takich jak:

• SARS-CoV-2,
• wirusy grypy A i B,
• HIV,
• wirus Ebola,
• RSV i inne patogeny oddechowe.

Proces obejmuje dwa główne etapy:

1. Odwrotna transkrypcja (RT)

RNA wirusa zostaje przepisane na komplementarny DNA (cDNA) przy pomocy enzymu odwrotnej transkryptazy.

2. Reakcja PCR

Utworzony materiał DNA jest następnie amplifikowany, czyli powielany miliony razy, co umożliwia wykrycie nawet śladowych ilości materiału genetycznego.

Jeżeli analiza wymaga określenia ilości wirusa w próbce, stosowana jest technika qRT-PCR (quantitative RT-PCR), umożliwiająca ilościową ocenę poziomu zakażenia.

Co wpływa na wiarygodność badania RT-PCR?

W diagnostyce molekularnej nawet niewielkie zanieczyszczenie może wpłynąć na wynik analizy. Dlatego laboratoria muszą stosować materiały eksploatacyjne spełniające rygorystyczne wymagania jakościowe.

Kluczowe znaczenie mają:

• certyfikowane końcówki do pipet,
• probówki i mikropłytki klasy diagnostycznej,
• odpowiednie warunki produkcji tworzyw laboratoryjnych,
• kontrola zanieczyszczeń biologicznych i chemicznych.

Materiały laboratoryjne wykorzystywane w badaniach RT-PCR powinny być wolne od:

• RN-az,
• DN-az,
• inhibitorów PCR,
• endotoksyn,
• DNA pochodzenia ludzkiego.
• RN-azy – niewidoczne zagrożenie dla analiz RNA

Jednym z największych zagrożeń dla badań opartych na RNA są rybonukleazy (RN-azy).

Są to wyjątkowo trwałe enzymy obecne praktycznie wszędzie – na powierzchniach roboczych, skórze człowieka, odzieży laboratoryjnej czy w powietrzu. Nawet śladowe ilości RN-azy mogą spowodować rozkład RNA wirusa jeszcze przed rozpoczęciem analizy.

Konsekwencje mogą obejmować:

• utratę materiału genetycznego,
• obniżenie czułości testu,
• błędne wyniki diagnostyczne,
• konieczność powtarzania analiz,
• zwiększenie kosztów pracy laboratorium.

Dlatego laboratoria wykonujące badania molekularne powinny stosować wyłącznie końcówki do pipet i materiały eksploatacyjne posiadające certyfikaty potwierdzające brak wykrywalnych RN-az.

Automatyzacja laboratorium a bezpieczeństwo procesu diagnostycznego

Rosnąca liczba badań molekularnych sprawia, że laboratoria coraz częściej wdrażają automatyzację przygotowania próbek i dozowania cieczy.

 

 

 

 

W takich zastosowaniach szczególnego znaczenia nabierają:

• powtarzalność objętości dozowania,
• integralność próbki,
• ograniczenie ryzyka kontaminacji,
• identyfikowalność procesu,
• zgodność z procedurami jakościowymi.

Wysokiej jakości systemy pipetowania oraz certyfikowane materiały eksploatacyjne wspierają utrzymanie integralności RNA i zwiększają wiarygodność wyników diagnostycznych.

Jakie cechy powinny mieć materiały eksploatacyjne do badań RT-PCR?

Przy wyborze wyposażenia do diagnostyki molekularnej warto zwrócić uwagę na następujące parametry:

• certyfikat braku RN-az i DN-az,
• brak inhibitorów PCR,
• wysoka czystość materiałów polimerowych,
• kontrolowane warunki produkcji,
• pełna dokumentacja jakościowa,
• zgodność z wymaganiami laboratoriów diagnostycznych i badawczych.
• Podsumowanie

Skuteczność diagnostyki RT-PCR zależy nie tylko od zastosowanej metody analitycznej. Równie istotne są jakość pobrania próbki, zachowanie integralności RNA oraz wykorzystanie certyfikowanych materiałów laboratoryjnych wolnych od zanieczyszczeń biologicznych.

W badaniach opartych na RNA nawet śladowe ilości RN-az mogą wpłynąć na wynik. Dlatego laboratoria zajmujące się diagnostyką molekularną powinny stosować rozwiązania gwarantujące najwyższą czystość procesu oraz pełną powtarzalność pracy.

FAQ
Dlaczego RNA jest tak wrażliwe podczas diagnostyki RT-PCR?

RNA łatwo ulega degradacji pod wpływem enzymów RN-azy obecnych w środowisku laboratoryjnym. Nawet minimalne zanieczyszczenie może wpłynąć na wynik badania.

Co powoduje wyniki fałszywie ujemne w testach RT-PCR?

Najczęściej są to: nieprawidłowe pobranie próbki, niski poziom wirusa w organizmie, niewłaściwy moment wykonania badania lub degradacja RNA.

Dlaczego końcówki do pipet mają znaczenie w badaniach molekularnych?

Końcówki mają bezpośredni kontakt z próbką. Obecność RN-az, DN-az lub inhibitorów PCR może zakłócić reakcję i obniżyć wiarygodność wyniku.

Jakie materiały eksploatacyjne należy stosować do analiz RNA?

Materiały certyfikowane jako wolne od RN-az, DN-az, endotoksyn i inhibitorów PCR, przeznaczone do zastosowań biologii molekularnej.